桂枝茯苓丸对盆腔炎性疾病模型大鼠子宫、卵巢组织中VEGF表达的影响

　   桂枝茯苓丸对盆腔炎性疾病模型大鼠子宫、卵巢组织中VEGF表达的影响

　　谢知慧，包红桃，董娟娟，刘双萍，陈嘉玲甘肃中医药大学，甘肃兰州730000

　　摘要：目的观察桂枝茯苓丸对盆腔炎模型大鼠子宫、卵巢组织中血管内皮生长因子( VEGF')表达的影响，旨在为临床运用活血化瘀药物桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病提供参考。方法运用“混合细菌接种”法进行造模，造模成功后第7天后给予相关药物治疗21 d。治疗结束后计算大鼠子宫、卵巢指数，使用免疫组化法观察子宫、卵巢组织病理学变化。结果桂枝茯苓丸可降低盆腔炎模型大鼠的体质量，增加子宫(卵巢)指数;与空白对照组、甲硝唑组、假手术组比较，模型组大鼠ECIr表达明显提高，子宫、卵巢炎症变化，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明造模成功;与甲硝唑组比较桂枝茯苓丸组大鼠卵巢组织中WF.GF显著下降，盆腔炎症显著改善，差异均有统计学意义(P<o.01)。结论桂枝茯苓丸能通过活血化瘀来降低炎症局部组织中细胞因子vegf的水平，从而减少纤维蛋白原渗出、沉积，促进纤维蛋白溶解与合成的平衡，减少细胞外基质的沉积，进而减少腹膜粘连的形成。同时也可降低局部过度的炎症反应，降低血管通透性，减少和抑制粘连发生，促进损伤组织修复。

      关键词：盆腔炎性疾病;桂枝茯苓丸;血管内皮生长因子

　　中国图书分类号：R332文献标识码：A文章编号：1001-4411(2018)11-2565 -04;doi：10.7620/zgfybj.j ]ssn.1001 -441】.2018. 11. 55

　　盆腔炎性疾病( PID)是由女性上生殖道炎症引起的一组疾病，包括子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿和盆腔腹膜炎。PID是临床妇科的常见病、多发病，主要表现为腹痛、带下、盆腔组织发生增厚、粘连以及形成盆腔包块等。近年来，性传播疾病的发病率呈逐渐上升趋势，第一次性交的年龄趋向更年轻化，加之人工流产手术的提高等因素，致使盆腔炎的发病率逐渐急剧增加。盆腔炎反复发作，能够导致官外孕、不孕以及神经官能症等，严重影响妇女健康。目前，临床研究的重点课题之一仍是如何防治盆腔炎。医学界对于PID缺乏理想的治疗药物，常规西医治疗虽能迅速消除炎症，缓解其炎性症状，但复发率高，长期效果欠佳，故长期服用抗生素预防PID显然也是一种不切实际的预防措施。中医认为凡血液的浓、粘、凝、聚程度增加，流动阻滞;或渗溢出脉管之外而成为离经之血，均属瘀血。无论是何证型，“瘀”贯穿始终，所谓“一切不治之症，总由不善去瘀之故”。随着国内外对“血瘀证”研究的逐渐深入，认为“瘀”是盆腔炎性疾病的病理核心，临床辨证用药从瘀立论。很多研究表明，活血化瘀类中药能调节整体机体免疫，有抗菌消炎的作用。本实验通过建立盆腔炎动物模型，以免疫调节角度出发，分析桂枝茯苓丸对盆腔炎模型大鼠血管内皮生长因子( VEGF)表达的影响，旨在为临床应用活血化瘀类药物治疗盆腔炎提供理论与数据的支持。现将研究结果报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1 实验动物 选用SPF级雌性未孕SD大鼠140只，体质量(180+20)g，适应性饲养7d，购自甘肃中医药大学SPF级实验室，实验动物合格证号：NO. 62001000000249。

　　1.2药品桂枝茯苓丸(生产厂家：明致集团万荣药业有限公司，批号：国准药字220027563，剂型：浓缩水丸，规格：2.2 g)、甲硝唑[生产厂家：远大医药(中国)有限公司，批号：国药准字H42021947，剂型：片剂，规格：0.2 g]、血管内皮生长因子( VEGF)试剂盒(免疫组化法)均购自欣博盛生物科技有限公司;混合细菌悬液(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌)由甘肃中医药大学微生物教研室馈赠。

　　1.3 仪器 -80℃低温冰箱(MDF-U32V)、PG3022A型酶联免疫检测仪、高速低温离心机、电子分析天平、酶联免疫测定仪、超声探头频率5 Hz全自动生化分析仪(德国·罗氏CABOS-8000)、显微镜、水温计、注射器、灌胃针、试管、滤纸、标本瓶、载玻片及手术器械等。

　　1.4动物分组及造模方法

　　1.4.1 分组 140只大鼠造模随机分为5组，造模后从第5天开始，由各组中随机抽取10只，无菌操作取下大鼠子宫卵巢组织，肉眼观察可见子宫明显肿胀，官腔充满脓性泌物;10%的甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下进行组织形态学观察。光镜下上皮细胞变形、坏死，官腔内充满分泌物并偶见出血，内膜层出血水肿。有单核细胞和淋巴细胞浸润提示造模成功。造模成功后剩余大鼠分为：假手术组20只，空白对照组20只，模型组20只，桂枝茯苓丸组35只，对照组甲硝唑组35只。

　　1.4.2造模方法 大鼠用10%的水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔麻醉后，抽取0.2 ml含3xl09/L的混合细菌悬液(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌按2:1:1混合配成3xl0'2 CFU/ml)，于阴道内子宫颈分叉处小心进入一侧官腔内，磨钝针头在官腔内来回抽拉几次以机械性损伤子宫内膜组织，然后朝卵巢方向注射混合菌液0.1 ml，同样操作步骤将0.1 ml茵液注入另一侧，注射完毕后将大鼠倒置10 min，以防菌液漏出。假手术组手术操作步骤同上，但只朝卵巢方向注射等量0. 9%生理盐水0.2 rr1113[5].

　　1.5给药方法造模成功后第7天，开始灌胃给药，各组动物均按体表面积折算成人的等效剂量灌胃。按成人平均体质量60 kg，折合到大鼠用药剂量。桂枝茯苓丸组按0.50 g.kg。1.d一灌胃;甲硝唑按0. 02 g.kg。1.d一给药。假手术组、模型组均分别灌服等体积蒸馏水，每周根据大鼠体质量的变化调整药物剂量，连续给药21 d，空白组不予任何处理，正常饲养。

　　1.6观察指标 末次给药th后摘取大鼠子宫、卵巢，肉眼观察后，0. 9%生理盐水冲洗，除去血液，滤纸吸干，子宫、卵巢称重，计算脏器指数。子宫(卵巢)指数(%)=双侧子宫(卵巢)质量(g)/体质量(g)×100%。后用10 010的甲醛水溶液给予固定，石蜡包埋标本，切片，HE染色等。每组动物取相同序号的5张切片，应用免疫组化SP法检测大鼠子宫、卵巢组织的血管内皮生长因子( VEGF)(具体方法按试剂盒说明操作)。VEGF的免疫组化染色强度通过图像分析系统定量分析。彩色图像分析仪测定的灰度数值可作为免疫组化片阳性区域表达的定量指标。灰度值是图像各部分颜色的深浅程度，在同一光照强度下，阳性区域强弱的不同导致所吸收或透光的数值不同，故显示了灰度的差异。阳性区域表达的强弱和灰度值成负相关，灰度值大则阳性表达弱。

　　1.7统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以(x+s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析( One-Way-ANOVN)检验，P<o. p="" 05差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 子宫、卵巢指数的表达桂枝茯苓丸对盆腔炎模型大鼠的子宫、卵巢指数表达的影响见表1。

　　假于A9n. 20 183.01+13.14 0.43±0.04

　　模型组 桂枝茯苓丸组

　　20

　　35

　　191. 15+i6. 84a

　　185. 37+14. 511)

　　0. 31+0. 05:1

　　0. 23+0. 30

　　0. 16+0. 17"

　　0. 15 +0. 01

　　0. 12 +0. 01il

　　0. 08+0. 07

　　0. 06+0. 05 a]

　　0. 45 +0. 02l' 0. 24+0. 13i' 0. j 4 +0. 02l' 0. 07 +0. 231'

　　模型对照组大鼠的子宫(卵巢)指数与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<o. 05);各用药组与模型对照组比较，差异有统计学意义(p0.05)。造模后大鼠体重有所增加，用药后则有所降低;造模后大鼠子宫(卵巢)湿重及子宫(卵巢)指数降低，用药后均有所增加，各用药组间比较，差异无统计学意义(Jp>0.05)。桂枝茯苓丸可降低盆腔炎模型大鼠的体质量，增加子宫(卵巢)指数。

　　2.2子宫、卵巢组织VEGF的表达 空白对照组与假手术组相当，与空白对照组和假手术组比较，模型组大鼠子宫、卵巢组织中VEGF的明显升高，提示大鼠盆腔炎模型制作成功;与模型组比较，甲硝唑组大鼠子宫、卵巢组织中VEGF有所下降(P<0.05)，提示甲硝唑组对盆腔炎疾病具有治疗作用;而与甲硝唑组比较，桂枝茯苓丸组大鼠子宫、卵巢组织中的VEGF的表达显著降低(JP<0.01);提桂枝茯苓丸组对于盆腔炎性疾病的治疗优于甲硝唑组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1、图2。

　　表2桂枝茯苓丸对盆腔炎模型大鼠的子宫

　　VECF表达的影响(i±0)

　　组别 只 子宫组织 卵巢组织

　　空白对照组 20 20. 13 +1. 47 22. 37+1. 28

　　假手术组 20 19. 28+1. 19a 21. 62+1. 31ai

　　模型组 20 36.7 J±1. 04“ 38. 96+1.J5t)

　　桂枝茯苓丸组 35 50 27+4. 81J" 48. 92+4. 75 ah

　　甲硝唑组 35 44. 19+3. 74'.}， 46. 83±4. 03 ah

　　注：a.与模型组比较：假手术组各指标f值：仁3. 84，拉4.31，桂枝茯苓丸组各指标￡值：t8.04，扛6.59，甲硝唑组符指标'值：忙7.12,t=3. 65，P<o. p="" 81.p<o.01.

　　3讨论

　　桂枝茯苓丸是《金匮要略》的经典方剂，是公认的活血化瘀方，由桂枝、茯苓、赤芍、桃仁、牡丹皮五味药物组成，有温经通络、缓消瘕块之功。是治疗妇科血瘀证的经典方和临床常用药，本实验从瘀立论，并据此确切地建立活血化瘀为根本治疗大法，使瘀滞胞宫之瘀血得祛，气血运行通畅，瘀滞得除，疾病向愈。

　　西医学认为炎症是粘连形成的重要原因，VEGF表达位于炎性细胞浸润的部位，表明VEGF的形成与炎性细胞关系密切。VEGF表达高，可促使粘连组织中产生更多的新生毛细血管，导致Ⅷ因子表达高。VECF是目前公认的关键的促血管形成因子，VEGF可刺激血管内皮细胞增殖，是组织细胞产生的功能强大且能产生多种效应的血管内皮细胞特异性有丝分裂原，具有促进血管新生、微静脉、小静脉通透性增加、血管内皮细胞分裂、增殖、细胞质钙聚集以及诱导血管生成等作用。降低VEGF的表达而抑制毛细血管的新生，导致粘连组织的营养和氧供减少，从而减少粘连的形成，这可能是其有效预防粘连的机之一.，近年大量实验研究表明[16]，炎症多瘀，且炎症多表现有疼痛的症状，所以活血化瘀法在各种炎症的治疗中发挥着重要的作用。活血化瘀药物桂枝茯苓丸可以对血液流变学、微循环、血液凝固性、免疫学、抑制病原微生物等诸方面产生影响。同时具有控制炎症，促进组织修复、软化纤维组织等功用。炎性反应机制与现代中医学对盆腔炎性疾病认识所存在的“虚、瘀”等病理特点存在相关性，其因气虚无力运血则血行迟缓，日久可致血瘀;病程日久，血稠难行而至瘀，络脉瘀滞，通过大量临床及动物实验我们认为“寒湿瘀滞”是PID的核病机，寒湿瘀不祛，脾胃运化受损，水谷不化，聚集一处，无以布散而营养全身，易出现腹型肥胖等。

　　桂枝茯苓丸具有抑制盆腔炎模型大鼠盆腔血管生成能力，并且这种作用可能是通过下调VEGF实现的。甲硝唑也降低VEGF的表达，对于盆腔炎性疾病的治疗有较好的治疗效果;但活血化瘀药物桂枝茯苓丸可显著抑制VEGF的表达，而且对VEGF分泌的抑制足以减少炎症因子诱导的血管生成。说明桂枝茯苓丸对于盆腔炎性疾病的治疗具有显著的作用，从侧面活血化瘀法可调整组织中各免疫分子的表达，使之趋于正常，从而起到减轻和消除炎症，抑制盆腔粘连的治疗作用。此外，尚可减低模型组体质量接近正常组，说明此药对寒湿瘀滞具有改善作用。基于寒湿瘀阻，辨证治疗运用桂枝茯苓丸，以改善盆腔局部微血管血液循环，抑制新血管生成，散寒除湿化瘀，减轻寒湿瘀血阻滞，从而改善盆腔炎症状态，减轻对子宫(卵巢)的损伤及体质量的日益增加。

　　桂枝茯苓丸具有抑制盆腔炎模型大鼠血管新生的作用，其机制可能与抑制VEGF的分泌有关，尚可使模型大鼠体质量有减轻，接近空白组，可能与体内存在寒湿瘀有关。值得临针对该病机对实验中的大鼠模型所施行的化瘀通络中药干预，确实改善了模型大鼠的部分症状和盆腔损伤的程度，并使瘀血相关的实验室指标得到了较明显的改善，此外通过中医以方测证的方法，佐证了本实验中盆腔炎大鼠模型“瘀”的存在。

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