微生物学实验指导

　　这份资料是由华南师范大学生命科学学院的黄文芳、张松编著出的一份资料。这份资料分四部分介绍，第一部分是基础实验，第二部分是实际应用实验，第三部分专题实验，第四部分微生物实验技能的测评。小编就给大家举例资料中的部分实验。

　　第一部分 基础实验

　　细菌芽孢、荚膜的染色及观察实验

　　一、实验目的和内容

　　目的：掌握细菌的芽孢及荚膜染色方法。

　　内容：1.细菌的芽泡染色。

　　2.细菌的荚膜染色。

　　二、实验材料和用具

　　枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。

　　二甲苯、香柏油、蒸馏水、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液(或 0.05%碱性复红)、绘

　　图墨水(用滤纸过滤后备用)、95%乙醇、石炭酸复红染液;

　　显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(l×6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、

　　试管夹、擦镜纸、吸水纸。

　　三、操作步骤

　　(一)芽孢染色法

　　1.方法 1

　　(1)取 37℃培养 18～24h 的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”)。

　　(2)于涂片上滴人 3～5 滴 5%孔雀绿水溶液。

　　(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间

　　约 4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。

　　(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

　　(5)用 0.5%沙黄水溶液(或 0.05%碱性复红)复染 lmin，水洗。

　　(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。

　　2.方法 2

　　(1)加 1～2 滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取 2～3 环培养 18～24h 的枯草

　　芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。

　　(2)加 5%孔雀绿水溶液 2～3 滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

　　(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热 15～20min。

　　(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火 3

　　次固定。

　　(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

　　(6)加沙黄水溶液，染 2～3min 后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。

　　(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。

　　(二)荚膜染色法

　　1.石炭酸复红染色

　　(1)取培养了 72h 的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。

　　(2)滴入 1～2 滴 95%乙醇固定(不可加热固定)。

　　(3)加石炭酸复红染液染色 1～2min，水洗，自然干燥。

　　(4) 在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，再以匀速推

　　向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。

　　(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。

　　2.背景染色

　　(1)先加 1 滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。

　　(2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的

　　菌液。

　　(3)干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。

　　四、注意事项

　　1.荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。

　　2.供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。

　　五、实验报告

　　(一)绘图

　　1.枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。

　　2.褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。

　　(二)试制片，但不进行染色，观察是否能看到芽孢和荚膜?

　　七、问题和思考

　　1.为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色?

　　2.组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?

　　3.试设计实验如何鉴定某一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。

　　第二部分 专题实验

　　微生物的诱变育种

　　一、实验目的和内容

　　目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种

　　的基本操作方法。

　　内容：1.对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。

　　2.用紫外线进行诱变处理。

　　3.用平板透明圈法进行两次初筛。

　　4.用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。

　　二、实验材料和用具

　　米曲霉斜面菌种;

　　豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白;

　　三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、

　　磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。

　　三、操作步骤

　　(一)出发菌株的选择及菌悬液制备

　　1.出发菌株的选择 可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲

　　霉菌株。

　　2. 菌悬液制备 取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养 3～5d 活化。然后孢

　　子洗至装有 1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺

　　满瓶底为宜)，30℃振荡 30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度

　　为 106

　　～108个/mL，冷冻保藏备用。

　　(二)诱变处理

　　用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可

　　采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。

　　1.紫外线处理 打开紫外灯(30W)预热 20min。取 5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)

　　中，同时制作 5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯 30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器

　　上，照射 l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅

　　拌，即时计算时间，照射时间分别为 15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液

　　在黑暗冷冻中保存 1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。

　　2.稀释菌悬液 按 10 倍稀释至 10-6，从 10-5 和 10-6 中各取出 0.lmL 加入到酪素培养

　　基平板中(每个稀释度均做 3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于 30

　　℃恒温培养 2～3d。

　　(三)优良菌株的筛选

　　1. 初筛 首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之

　　比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落 40～50 个，作为复筛菌株。

　　2.平板复筛 分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心

　　划线至周边分成 8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第 8 份点种原始菌株，作为对照。培养

　　48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，

　　进大摇瓶复筛阶段。

　　3.摇瓶复筛 将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取

　　麦秩 85g，豆饼粉(或面粉)15g，加水 95～110mL(称为润水)，水含量以手捏后指缝有水而不

　　下滴为宜，于 500mL 三角瓶中装入 15～20g(料厚为 1～1.5cm)，121℃湿热灭菌 30min，然

　　后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h 后摇瓶一次并均匀铺开，再培养 24～

　　48h，共培养 3～5d 后检测蛋白酶活性。

　　4.蛋白酶的测定方法

　　(1)取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物 1g，加蒸馏水 100mL，(或 200mL),40℃水浴，

　　浸酶 1h，取上清浸液测定酶活性。另取 lg 培养物于 105℃烘干测定含水量。

　　(2)酶活性测定：30℃ pH7.5 条件下水解酪蛋白(底物为 0.5%酪蛋白)，每分钟产酪氨酸

　　1μg 为一个酶活力单位。计算公式为：

　　(A 样品 OD680nm 值-A 对照 OD680nm 值)×K×V/t×N

　　K：标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数;

　　V：酶促反应的总体积;

　　t： 酶促反应时间(min);

　　N：酶的稀释倍数。

　　5.谷氨酸的检测 此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。

　　检测培养基：豆饼粉：麸夫=6：4，润水 75%，121℃湿热灭菌 30min。

　　谷氨酸测定：于以上培养基中加入 7%盐水(W/V)，40～45℃水浴，水解 9d 后过滤，以

　　滤液检测谷氨酸含量(测压法)。

　　四、注意事项

　　1. 紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。

　　2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。

　　五、实验报告

　　1. 试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。

　　2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进?

　　六、问题和思考

　　1.试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。

　　2.为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间?

　　注：筛选菌株数的计算 若按突变率为 0.01 计算，则一次筛选可取 250—300 个菌落，

　　第一次筛选后可多选几株高产株，而二级筛选为重点阶段，其适量可参考以下计算方法：

　　如初筛菌株数为 200 株，二次筛选欲选株数为 2 株，则二级应选(200×2)1/2，为 20 株，这样

　　的数量选择，使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。

　　实验时在医学科研中必不可少的一部分，而参阅文献资料也是不可少的，小编给大家整理的这份微生物学实验指导，读者可以参阅起来。小编已将文档上传至网页中，大家可通过以下方式获取：

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